Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов - Сванте Пэабо Страница 21

В сентябре 1991 года в Эцтальских Альпах, на границе Австрии и Италии, неподалеку от седловины Хауслабьох два туриста нашли мумифицированные останки человека. Сначала их приняли за труп современного происхождения, жертву войны или попавшего в снежный шторм несчастного альпиниста. Но когда тело извлекли изо льда, то по остаткам одежды и снаряжению стало понятно, что это не солдат и не альпинист. Погибший жил примерно на 5300 лет раньше, то есть в бронзовом веке. Из новостных сообщений я узнал, что на право обладать мумией претендует и Австрия, и Италия. Еще там говорилось о распрях между первооткрывателями и властями относительно награды за находку, а также о трудностях патологоанатомов Инсбрукского университета, которые ревниво охраняли замороженные останки от посторонних. Короче, все как обычно. Потому я был несказанно удивлен, когда ко мне пришел профессор из Инсбрука и предложил заняться анализом ДНК Эци – так назвали замороженного человека из Альп, по месту, где его обнаружили. Мы рассудили, что останки, пролежавшие нетронутыми в замороженном виде пять тысяч лет, должны были сохраниться гораздо лучше, чем египетские или американские мумии. И решили попробовать.

Мы с Оливой поехали в Инсбрук, где патологоанатомы отделили для нас восемь маленьких образцов из левого бедра Эци; это место на мумии уже было повреждено ледорубами, когда альпинисты, не подозревая об уникальности находки, выбивали ее изо льда. В Мюнхене Олива приступила к работе – к выделению и размножению ДНК. Ей удалось провести ПЦР и получить приличные нуклеотидные цепочки – и мы было обрадовались. Но выяснилось, что эти выделенные последовательности невозможно интерпретировать. Во многих позициях она обнаружила не один, а несколько разных нуклеотидов. Чтобы разобраться с этим, ей пришлось вернуться к старому методу клонирования, какой я практиковал в Упсале. Она вставляла каждый из производных ПЦР в бактерий, а затем секвенировала клоны. Так как каждый клон происходил от единственной бактерии с конкретным фрагментом ДНК, амплифицированным с помощью ПЦР, можно было отследить источник разнообразия фрагментов. Если все клоны окажутся одинаковыми, то, значит, вставленные в них фрагменты ДНК были одинаковыми. А если клоны выйдут разными, то, значит, и в ПЦР амплифицировались фрагменты от разных индивидов. Верным оказалось последнее: из разных образцов получался разный набор последовательностей. Выходила ерунда. Конечно, большая часть выделенной ДНК должна принадлежать тем, кто соприкасался с Ледяным человеком после того, как его нашли. И как нам прикажете определить, древняя это ДНК Эци или современная? Ведь Эци жил не так уж давно с эволюционной точки зрения, поэтому его мтДНК, безусловно, практически та же, что и у современных европейцев, а те самые современные европейцы, очевидно, контактировали с ним, когда его нашли.

Нам повезло: два образца из Инсбрука оказались сравнительно крупными, так что мы смогли снять верхний слой ткани и взять пробу из внутренней части, к которой никто не прикасался. Мы надеялись, что так большая часть загрязнений останется на поверхности. Это спасло положение, но только частично. Вариации в шести позициях, которых по предположению Оливы должно было быть существенно меньше, разошлись по трем или четырем индивидам. Но аккуратно разгруппировать все последовательности (всю сумму различий) на три или четыре кучки не удавалось. Варианты по каждой из шести позиций были беспорядочно рассеяны по молекулярным цепочкам. Особенно если рассматривать позиции, разделенные относительно крупными участками. Очевидно, так получалось из-за эффекта “прыгающей ПЦР”, который я описал в Беркли, когда вместо последовательного копирования одной молекулы полимераза сшивает кусочки фрагментов ДНК в новых комбинациях. Можем ли мы отделить эти химерные комбинации от настоящих, принадлежащих Ледяному человеку (если таковые вообще имеются)?

Мы рассудили, что “прыжки ПЦР” происходят скорее при попытках копирования длинных фрагментов, потому что короткие фрагменты будут вероятнее отражать оригинальную версию фрагмента, а длинные – сшитую или происходящую от контаминантов. Олива проделала ПЦР самых коротких фрагментов. И это сработало. Если амплифицировались отрезки не более 150 нуклеотидов, то не только “прыжки ПЦР” прекращались, но и во всех клонах получалась одна и та же последовательность. Картина немного прояснилась. В нашей пробе содержалась одна мтДНК, которой было сравнительно много, но она рассыпалась на много коротких кусочков. Также там были и более длинные фрагменты мтДНК двух-трех людей, но в меньшем количестве. По нашему мнению, короткие фрагменты принадлежали Ледяному человеку, а более длинные – людям, привнесшим современное загрязнение. Олива размножила каждый короткий кусочек, в каждом случае проделав это дважды, затем клонировала фрагменты в бактериях, затем секвенировала клоны… и в результате смогла сложить последовательность мтДНК, которую, по всей вероятности, и имел в свое “живое” время Ледяной человек. Оливе удалось собрать из перекрывающихся фрагментов участок в 300 нуклеотидов или чуть больше. Он отличался от аналогичного эталонного фрагмента мтДНК современного европейца двумя нуклеотидными заменами, у сегодняшних европейцев последовательность с такими заменами встречается. Не так уж и странно. Если пересчитать промежуток в 5300 лет на число поколений, скажем, для 80–90- летних долгожителей, то это даст около 250 поколений. С одной стороны, это число впечатляет, но для эволюционной перспективы маловато. Если не случится ничего катастрофического вроде эпидемии, вымирания или замещения популяции, то за 250 поколений в генах изменится не много. Мы с коллегами прикинули, что со времен медного века на участке ДНК, подобном нашему, могла закрепиться от силы одна мутация.

Но до публикации предстояло одолеть еще один барьер. Досадуя на множество крайне сомнительных статей по нашей теме, мы взяли за правило все наши результаты отдавать на проверку в независимую лабораторию. Конечно, в прочитанной нами последовательности не было ничего необычного с биологической точки зрения, но работа, безусловно, привлечет внимание, а значит, даст нам возможность показать, как нужно делать такие вещи. И мы решили отправить один из наших образцов в Оксфорд, Брайану Сайксу. Этот генетик, прежде изучавший болезни соединительных тканей, теперь переключился на исследование изменчивости человеческой мтДНК и ее древних вариаций. Он с готовностью согласился помочь. Один из студентов Сайкса экстрагировал и амплифицировал кусочек последовательности, которую мы ему описали, и отправил нам ответ. Получилась та же последовательность, что и у Оливы. И тогда мы все как следует описали и отправили в Science[34].

Несмотря на успех этого исследования, для себя я сделал другой вывод: с древними человеческими остатками работать чертовски трудно. Ледяной человек “хранился” в замороженном виде и потому необычайно хорошо сохранился; кроме того, со времени его находки прошло всего два года, то есть не так много людей имели возможность в буквальном смысле приложить к нему руку и привнести загрязнения. И все же мы с трудом разобрались с целым букетом чужеродных последовательностей. Наш успех можно отнести только за счет упорства и терпения Оливы; помогло и правильное умозаключение, какие из последовательностей могут быть “родными”. Тут нужно было понимать, как разные группы молекул, длинных и коротких, появились в образце. Поэтому даже подумать страшно об изучении недавней эволюции современного человека, если придется иметь дело с множественным материалом, представленным в виде разрозненных скелетов. Это кошмар.